血管新生是从既有的血管芽中生长的自然和病理过程。在癌症和心血管疾病中扮演着重要角色。主动脉环实验是研究血管新生的一种方法。在这个实验中，我们以大鼠的主动脉为研究材料，清理了主动脉周围的组织并将其切成1mm长的环。接下来，将这些环培养在37°C下的基质胶中。通过倒置显微镜平台，在7天时评估血管新生。
01材料和试剂
1、10cm培养皿
2、24孔培养板
3、2ml和5ml一次性灭菌注射器
4、4周龄大鼠
5、低生长因子基质胶
6、DMEM培养基
7、胎牛血清
8、PBS
9、70%乙醇
10、4%水合氯醛
02设备
1、外科剪刀、手术刀和镊子
2、尺子
3、37°C、5% CO₂的细胞培养箱
4、倒置显微镜
5、电子天平
03软件
Image-Pro Plus 6.0
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04操作步骤
注意：整个实验过程应在无菌条件下进行，包括所有材料和试剂。所有操作都应具备无菌性。
1、将基质胶从-20°C冷冻保存到4°C冰箱中融化过夜。
2、将24孔培养板和移液器吸头放入-20°C冷冻保存过夜。
3、使用电子天平称量大鼠的重量。
4、使用5ml一次性灭菌注射器向大鼠腹部注射4%水合氯醛，每100g体重注射1ml水合氯醛以使大鼠麻醉，然后通过颈椎脱位的方式处死动物，将大鼠放置在动物手术无菌条件下。
5、向大鼠皮肤喷洒70%乙醇并将大鼠固定。
6、使用剪刀打开胸腔，移除其他器官以显露胸腔主动脉（见图1和2）。
图1. 将大鼠放置在动物手术无菌操作区。
图2. 打开胸腔并移除其他器官，暴露胸主动脉。
7、用镊子和剪刀将脊柱和主动脉分开(图3)。
图3. 使用镊子和剪刀分离脊柱和主动脉。
8、从膈到心脏末端切割主动脉，然后将其放入10厘米培养皿中，用室温下的无菌PBS洗涤主动脉（见图4）。
图4. 从膈肌切割主动脉，直至心脏末端。
9、小心清理主动脉周围的组织（见图5）。
图5. 清理主动脉周围的组织。
10、使用手术刀根据尺子测量，将主动脉切成长约1mm的环状截段（见图6）。
图6. 使用手术刀将主动脉切成长度为1毫米的环节，按照尺子测量。
11、将基质胶保持在冰上。然后在生物安全柜中向24孔培养板中的每个孔中添加150 µl 基质胶。每组三个复孔。
注意：a. 操作基质胶时要迅速而小心。在室温下容易凝固。b. 在将基质胶添加到孔中之前将其放在冰上，但是培养皿不需要放在冰上，培养皿在加入基质胶之前应冷却。c. 添加基质胶后，轻轻摇晃培养皿确保整个表面都被基质胶覆盖。如果孔中有气泡，使用2ml灭菌注射器将其破裂。
12、轻轻摇动培养皿，然后将其放入普通的湿度控制培养箱中孵育30min（37°C）。
13、将1mm主动脉环放置在每个孔的中间。
14、然后在普通的湿度控制培养箱中孵育约10min（37°C）。
15、向孔中再次添加150 µl基质胶以覆盖环。
16、然后在普通的湿度控制培养箱中孵育30min（37°C）。
17、由于主动脉环被埋在基质胶中，每孔加入200 µl含有10%胎牛血清的DMEM培养基，最后将24孔培养板放入培养箱中（37°C）（见图7）。
图7. 将主动脉环置于基质胶中，并用培养基覆盖在24孔板中
18、每隔2天更换培养基。
19、经过7天后，使用显微镜观察血管分支（见图8）。
图8.经过7天，使用显微镜观察血管分支。比例尺，100μm。
20、使用Image-Pro Plus 6.0软件检测发芽长度和范围。使用Image-Pro Plus 6.0软件对每个环的总血管生长进行求和。计算每个环的所有分支的总长度，以便在组内进行比较。
05注意事项
1、在此方案中，我们只使用一种培养基（通用培养基）进行培养。
2、可以收集不同种类的培养基，以形成多个组。通常我们设立几个组来比较对主动脉环起作用的不同上清液。
3、每个组需要设立三个复合孔。
转自：模基生物
